一、免疫組織化學技術的基本原理

應用免疫學和組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位定性、定位或定量研究，稱為免疫組織化學或免疫細胞化學。

眾所周知，抗體與抗原的結合具有高度的特異性。免疫組織化學就是利用這一特性，即先提取組織或細胞中的一些化學物質，然后作為抗原或半抗原免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體。然后將此抗體(第一抗體)作為抗原免疫動物制備第二抗體，用某種酶(常用的辣根過氧化物酶)或生物素處理，再與前述抗原成分結合，擴增抗原。由于抗體與抗原結合形成的免疫復合物是無色的，所以需要借助組織化學方法顯示抗原與抗體的反應部位(常見的顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒)。

通過抗原抗體反應和顯色反應，可以顯示細胞或組織內(nèi)的化學成分，在顯微鏡下可以清楚地看到細胞內(nèi)抗原抗體反應的產(chǎn)物，從而可以原位確定某些化學成分在細胞或組織內(nèi)的分布和含量?；蛘呓M織中任何可以作為抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸、病原體等，都可以通過相應的特異性抗體進行檢測。

二、免疫組織化學染色法

1.根據(jù)標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等?？煞譃?a href="http://m.justonewife.com/" target="_self">免疫熒光法、放射免疫法、酶標記法和免疫金銀法等。

2.按染色步驟可分為直接法(也稱一步法)和間接法(二步法、三步法或多步法)；與直接法相比，間接法的靈敏度要高得多。

3.根據(jù)結合方法可分為抗原抗體結合法，如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法和親和連接法，如卵清蛋白-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法和鏈霉菌親和素-過氧化物酶連接(SP)法，其中SP法是最常用的方法。

三、幾種常用免疫組織化學方法的原理

1.免疫熒光法

這是最早建立的免疫組織化學技術?；诳乖贵w特異性結合的原理，將已知的抗體用熒光素標記，作為探針檢查細胞或組織中相應的抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受到激發(fā)光照射時，會發(fā)出一定波長的熒光，從而可以確定抗原在組織中的位置，進而進行定量分析。免疫熒光技術因其特異性強、靈敏度高、快速簡便而廣泛應用于臨床病理診斷和檢驗。

2.免疫酶標記法

免疫標記是20世紀60年代繼免疫熒光之后發(fā)展起來的一項技術。基本原理是先將酶標記的抗體與組織或細胞反應，再加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒。通過光學顯微鏡或電子顯微鏡，定位細胞表面和細胞內(nèi)部的各種抗原成分。免疫標記技術是目前最常用的技術。

和免疫熒光技術相比，該方法具有以下優(yōu)點:定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適用于光鏡和電鏡研究。

隨著酶標記方法的快速發(fā)展，衍生出了多種標記方法。隨著方法的不斷改進和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度也在不斷提高，使用也越來越方便。目前病理診斷中廣泛應用的有PAP法、ABC法和SP法。

3.免疫膠體金技術

膠體金技術使用膠體金，一種特殊的金屬顆粒，作為標記。金膠體是指金的水溶膠，能快速穩(wěn)定地吸附蛋白質，但對蛋白質的生物活性無明顯影響。因此，利用膠體金標記的一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白(如葡萄球菌蛋白A)的分子作為探針，可以對組織或細胞中的抗原進行定性、局部甚至定量的研究。由于膠體金具有大小不一的顆粒，且膠體金的電子密度高，因此免疫膠體金技術特別適用于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。膠體金本身是淺到暗紅色的，所以也適合光學顯微鏡觀察。比如應用銀增強免疫金銀法則，用光學顯微鏡觀察更方便。

四、免疫組織化學技術的優(yōu)勢

1.特異性強。免疫學的基本原理決定了抗原和抗體的結合具有高度的特異性。所以從理論上講，免疫組化也是抗原在組織細胞中的特異性展示，比如角蛋白展示上皮成分，LCA展示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時，才會發(fā)生交叉反應。

2.高靈敏度在免疫組化應用的初期，由于技術的限制，只有直接法和間接法等低靈敏度的技術。這時候抗體只能稀釋幾倍或者幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，稀釋幾千、幾萬甚至幾億倍的抗體仍能在組織細胞中與抗原結合。這種高度敏感的抗體-抗原反應使得免疫組織化學方法越來越方便地應用于常規(guī)病理診斷。

3.定位準確，形態(tài)與功能相結合。該技術可以通過抗原抗體反應和顯色反應在組織和細胞中準確定位抗原，使不同的抗原在同一組織或細胞中同時定位和觀察，從而研究形態(tài)和功能的結合，對病理學的進一步研究具有重要意義。