一、染色步驟

封閉

用5%空白山羊血清將樣本完全覆蓋，切片需放置于濕盒內(nèi)，細胞孔板可直接將孔板密封好，置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱孵育30min；

一抗稀釋

按照說明書要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；

一抗孵育

吸走封閉液，加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜；

復(fù)溫

將樣本置于常溫，復(fù)溫15min；

洗滌

去除抗體工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；

二抗稀釋

按照說明書要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；

二抗孵育

避光室溫1h；

洗滌

去除二抗工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；

染核/封片

在樣本上滴加DAPI工作液，避光，室溫，孵育10分鐘；去除DAPI工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；加入抗熒光衰減封片劑后，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

二、7大注意事項及技巧總結(jié)

封閉劑選擇和二抗種屬來源相同的血清，如果是直標一抗選擇和一抗種屬來源相同；

封閉時間不易過長，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可；

一抗孵育4℃過夜比較好，抗原抗體結(jié)合會比較充分；

選擇高質(zhì)量能滿足免疫熒光應(yīng)用和物種要求的一抗和熒光二抗，一抗二抗的稀釋比例可以根據(jù)抗體說明書來，再結(jié)合自己具體的實驗要求進行優(yōu)化；

如果涉及到雙標染色，切記要將兩種蛋白的抗體來源種屬區(qū)分開，二抗的熒光素也要區(qū)分開；

在洗滌過程中，一要注意動作輕柔，固定后的細胞比較脆弱，如果太過劇烈，很容易把細胞吹洗掉，二是洗滌時間要把握好，每次洗滌5min左右，三是切忌不要干片，防止背景過高；

細胞免疫熒光最好不封片，新手很容易在最后一步功虧一簣

文章出自：免疫熒光染色實驗      想了解更多請關(guān)注：http://m.justonewife.com/